تغییرات سیتوکین در مایع شکافی لثه پس از گذاشتن براکت

تغییرات مشخصات سیتوکین در مایع شکافی لثه پس از گذاشتن براکت ها

کارشناسان سایت کلینیک دندانپزشکی دشتستان دنتال عنوان می کنند که هدف از انجام این مطالعه بررسی ارتباط بین طراحی براکت و نسبت پنج سیتوکین التهاب زا، در مایع شکاف لثه (GCF)  و چسبندگی باکتریایی بدون تأثیر حرکت دندان است. طراحی این نوشتار را باید تشریح کنیم. نمونه شامل 20 نفر شرکت کننده 11 تا 15 ساله بود (میانگین سنی: 3/13 ± 03/1). براکت فلزی Gemini™ معمولی و دو براکت Self-ligating، شامل In-Ovation®R و SmartClip ™  به دندان های پیشین آرواره ای و دندان های نیش متصل شدند. GCF با استفاده از یک نوار کاغذی فیلتر استاندارد قبل و 60 روز پس از پیوند جمع آوری شد. مقادیر سیتوکین (IL-12، IL-1α، IL-1β، IL-6 و (TNF-α  با استفاده از آزمایش LUMINEX سنجش شد. سطوح کمپلکس های باکتریایی قرمز و نارنجی با استفاده از هیبریداسیون DNA-DNA  صفحه شطرنجی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده های سیتوکین و کمپلکس های باکتریایی با استفاده از آزمون های غیر پارامتری در سطح معناداری 5٪ انجام شد. يافته های این نوشتار بسیار مهم می باشند. افزايش سطح سيتوكين مشاهده شد. با این حال، تنها گروه SmartClip ™افزایش سطح قابل توجهی از TNF-α (046/0 (P=  را نشان داد. گروه براکت های SmartClip ™  مقادیر بیشتری از باکتری کمپلمس قرمز ارائه دادند. طراحي براکت بر ميزان سيتوكين و چسبندگي باكتريایی تأثير گذاشت، زيرا مشاهده شد كه سيتوكين هاي التهابي در GCF به گروه SmartClip ™ رهایش شد و  افزايشی در مقادیر TNF-α هم‌بسته با مقادیر باکتریایی بیشتر نشان دادند كه احتمالا نشان دهنده پتانسيل التهابي بيشتري است. بنابراين، طراحي براکت باید در بيماران با خطر بيماري بافت لثه و بازجذب ریشه مورد توجه قرار گیرد. امروزه، بیماران انتظار درمان هایی که موثر و سریع هستند و منجر به آسیب دندان ها و بافت های لثه نمی شوند را دارند.. در این زمینه، بسیاری از انواع براکت های ارتودنسی برای استفاده بالینی در دسترس هستند. براکت Self-ligating در مقایسه با براکت معمولی، مزایایی مانند کاهش زمان درمان، کاهش تعداد استفاده از تجهیزات دندانپزشکی و اثربخشی ارائه می دهند. صرف نظر از نوع، هر وسیله ارتودنسی، تغییرات قابل توجهی در هموستازی بافت پریودنتال (اطراف دندانی) بوسیله افزایش پلاک دندانی و انتشار واسطه های شیمیایی در شیارهای لثه ای ایجاد می کند. سیتوکین ها واکنش التهابی مزمن را در پریودنتیت القا می کنند. التهاب لثه موجب افزایش جریان خون، نفوذ پذیری عروقی و مهاجرت سلول های التهابی (نوتروفیل ها و ماکروفاژها) از خون پیرامونی به مایع شکافی می شود. در نتیجه، لنفوسیت های T و B در محل آسیب دیده ظاهر می شوند. سلول های میزبان سیتوکین هایی مانند IL-1α، IL-1β، IL-6، IL-8، TNF-α و پروستاگلاندین ها را تولید و انتشار می کنند. به این ترتیب، مقالات به نقش سیتوکین ها در حرکت ارتودنسی تاکید کرده اند.  در شرایط پاتولوژیک، این سیتوکین ها بازجذب استخوان را تنظیم می کنند که می تواند منجر به ایجاد استخوان یا بازجذب ریشه ای طی درمان ارتودنسی شود. بنابراین باید از قول کارشناسان کلینیک دندانپزشکی دشتستان دنتال بیان کرد این نکته را که برای ارزیابی اینکه آیا طراحی براکت موجب انباشت پلاک باکتریایی و افزایش التهاب بافتهای نگهدارنده می شود، گروه تحقیقاتی ما یک مطالعه کامل انجام دادند که شاخص های پریودنتال، رفتار باکتریایی و مایع شکاف لثه را 60 روز پس از پیوند دادن انواع مختلف براکت های ارتودنسی آنالیز کردند: براکت های خود اتصالی فلزی متداول (Gemini ™) و فعال (In-Ovation®R) و غیر فعالSmartClip ™) ). در ابتدا پارامترهای پريودنتال و حجم مايع شکاف لثه ارزيابی شد و تأييد شد که طراحی براکت بر شاخص پلاک و حجم مايع تأثیر گذاشته است. در این ویژگی ها، SmartClip ™ Self-ligating دارای بدترین عملکرد است. وقتی دینامیک باکتریایی همبسته با بیماری پریودنتال، بیش از 60 روز ارزیابی شد، یک الگوی آلودگی مشخص برای براکت های خوداتصالی مشاهده شد که نشان دهنده بالاترین سطح از گونه های باکتریایی درگیر در بیماری های پریودنتال بود. از یک جنبه چند سطحی، فرآیند پیوند، و همچنین طراحی براکت، ممکن است باعث تغییرات در بافت های لثه و پریودنتال شود، حتی در صورت عدم وجود نیروهای ارتودنسی. با این حال، تنها تعداد کمی از مطالعات بر روی ارزیابی این تغییرات با توجه به براکت های خود اتصالی متمرکز شده است. بنابراين هدف از اين مطالعه، ارزيابي سطح سيتوكين (IL-12، IL-6، IL1-α، IL-1β و (TNF-α  در مايع شکافی لثه و پروفايل کمپلکس باكتريایی، در جا، قبل و 60 روز پس از پیوستن براکتهای خود-لایتینگ و معمول می باشد. فرضیه صفر مورد آزمایش قرار گرفت که مشخص شد طراحی براکت روی مقادیر کمپلکس نارنجی و قرمز و پروفایل سیتوکین تأثیر نمی گذارد.

مواد و روش ها

کمیته اخالقی این مطالعه را تایید کرد (پروتکل تحقیق شماره 0062.0.138.000-10). رضایت بیماران یا والدین آنها قبل از مطالعه کسب شد. این پروتکل طبق استانداردهای اخلاقی بیانیه هلسینکی 1964 و ضمایم بعدی آن یا استانداردهای اخلاقی مشابه آن انجام شده است. محاسبه حجم نمونه با استفاده از برنامه SPSS SamplePower (بسته نرم افزاری نرم افزار آماری IBM برای علوم اجتماعی، شیکاگو ایلینویز، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. محاسبه براساس پنج عامل بود: 1 تفاوت بین میانگین های اولیه و نهایی؛2  پراکندگی نمرات؛3  از دست دادن نمونه؛ 4 مقدار آلفا 0.05؛ و 5 آنالیز bicaudal . نمونه ای از 20 نفر در هر گروه 80 درصد قدرت دارند. بيست بيمار مراجعه کننده به درمانگاه ارتودنسی در نمونه گنجانده شدند. افراد با توجه به معیارهای زیر انتخاب شدند: تاریخ درمان ارتودنسی قبلی، تاریخ درمان آنتی بیوتیک در 3 ماه گذشته، تاریخ مصرف داروهای سیستمیک، مصرف سیگار در حال حاضر، تشخیص بیماری سیستمیک و علائم ورم لثه و / یا پریودنتیت. بیماران مبتلا به بیش فعالی، پيشامدگى دندانهاى بالایی نیز از مطالعه حذف شدند. دستورالعمل های بهداشتی استاندارد توسط ارزیاب مشابه به تمام بیماران داده شد. بیماران با یک مسواک (Professional®، Colgate-Palmomive Industry، São Bernardo do Campo، SP، برزیل) و یک خمیر دندان (Oral-B® Pro-Saúde ©، 2012 Procter & Gamble of Brazil)

_ اتصال و جداسازی براکت

همه بیماران، براکت های فلزی دریافت کردند. دو تا self-ligating  (InOvation®R, Dentsply, GAC و  SmartClip™, 3M Unitek, Monrovia, CA,USA) و یک براکت معمولی استفاده شده با شریان بند الاستومری ((Gemini™, 3M Unitek, Monrovia, CA, USA. طرح ظاهری شش دندان قدامی برای توزیع انواع مختلف براکت ها در شش دندان قبلی انتخاب شده برای اتصال، طراحی شدند. بنابراین، براکت های مختلف با توجه به نوع براکت و زمان جداسازی لیست شده اند. براکت ها از 4 تا 6 مطابق توزیع زیر شماره گذاری شدند: شماره 4 با In-Ovation®R مطابقت داده شد، شماره 5 با (Gemini™, 3M Unitek, Monrovia, CA, USA). SmartClip™ bracket و شماره 6 مطابق با براکت Gemini ™ مطابقت یافت. 60 روز پس از اتصال جدا شدند. این تخصیص تصادفی همچنین تضمین کرد که تعداد هر نوع براکت جدا شده، شصت روز پس از پیوند، برای هر دندان قدامی مورد بررسی برای هر دو سمت چپ و راست مشابه بود. در کل 60 براکت پس از 60 روز پس از اتصال، 20 مورد از هر نوع برداشته شدند، به طور مشابه در میان عناصر مختلف دندانی توزیع شدند. سیستم (3M Unitek, Monrovia, CA, USA) برای پیوند انتخاب شد. پس از اتصال،" 0.014 archwire  ارتودنسی قرار داده شد. پس از 60 روز، براکت ها جدا شده و به داخل لوله هاي میکروتیوب های استريل کد بندی شده حاوي 150 ميکروليتر TE (10MmTris-HCl,1MmEDTA pH 7.6)  و در Vortex مخلوط شدند. براکت ها با استفاده از انبردست های استرلیزه شده جداش شده و سپس 100 میکرولیتر 0.5M NaOH  اضافه شده و در دمای 20-درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا زمانیکه هیبریداسیون صفحه شطرنجی DNA-DNA انجام شود، مطابق مرجع Bergamo et al. (2016). پس از این مرحله، تمام بیماران در درمان ارتودنسی اصلاحی ثبت نام کرده و براکت های جدیدی دریافت کردند.

_ جمع آوری مایعات شکافی لثه

در ابتدا، قبل از جمع آوری GCF و اتصال براکت، دندان ها سمباده زده شده، شسته و خشک شدند، مناطق با رول کتونی از هم جدا شده و به آرامی خشک شدند. GCF مطابق به Iwasaki، Haack، Nickel، Reinhardt و Petro (2001) جمع آوری شد. نوارهای جذب (PerioPaper®, Oraflow Inc., Plainview, USA) درون شیار ها قرار گرفتند. پس از نگه داشتن نوار در محل به مدت 30 ثانیه، حجم جذب شده با Periotron® 8000 (Oraflow Inc., Plainview, USA)) اندازه گیری شد. نوارها با آلودگی خونی از دور انداخته شدند. به منظور به حداقل رساندن تبخیر، حجم با بیشترین سرعت ممکن مورد بررسی قرار گرفت. سه نوار از سه محل در سطح داخل گونه (buccal) (میانی، مرکزی و انتهایی) در هر دندان جمع آوری شد. براکت ها پس از 60 روز جدا شدند و مجموعه GCF قبل از جداسازی، تکرار شد. نوار PerioPaper در میکروتیوب های استریل کد شده قرار داده شده و در دمای 70- درجه سانتیگراد تا زمان آنالیز سیتوکین ذخیره شد.

_ اندازه گیری سیتوکین ها

سطوح سیتوکین IL-12، IL-1α، IL-1β، IL-6 و TNF-α در GCF   در زمان T0 و T1 با استفاده از آزمون LUMINEX®  تعیین شدند. یک کیت (HCYTOMAG-60K-05; Milipore, Bilerica, MA, EUA) سیتوکین انسانی با حساسیت نوری بالا مطابق دستور العمل سازند، با استفاده از دستگاه انتقال چندگانه سیگنال MAGpix™ (MiraiBio, Alameda, CA, USA) استفاده شد. نمونه ها به صورت جداگانه ارزیابی شد و غلظت ها از منحنی استاندارد با استفاده از معادله چند جمله ای پنج پارامتری با استفاده از نرم افزار Xponent® (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)  ارزیابی شد. میانگین غلظت هر بیومارکر محاسبه شد، با حجم GFC تنظیم شده و به صورت pg / mL بیان شد. به طور خلاصه، یک پلیت با 96 چاهک با بافر شستشو،  مرطوب شدند که پس از آن دور انداخته شد و سپس با افزودن دانه های مغناطیسی میکروسفره پوشش داده شده با آنتی بادی های مونوکلونال علیه پنج آنالیت مختلف هدف به چاهک ها اضافه شدند. نمونه ها و استانداردها به چاهک ها اضافه شده و به مدت دو ساعت تحت هم زدن و در تاریکی انکوبه شدند. چاهک ها با استفاده از یک منیفولد مغناطیسی شسته شدند و مخلوطی از آنتی بادی های ثانویه بیوتین دار شده اضافه شد. پس از انکوباسیون به مدت 1 ساعت، استرپتاویدین به پروتئین فلورسنت RPycoerythrin متصل شده و به دانه ها اضافه شد و به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. پس از شستشو برای حذف عوامل های متصل نشده، مایع غلاف به چاهک ها اضافه شده و دانه ها (حداقل 50 عدد در هر آنالیت) در دستگاه تست چندگانه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.  نمونه ها با رقیق کننده های کیت، رقیق شدند. رقت در هنگام محاسبه غلظت هر ماده با یک منحنی استاندارد مورد توجه قرار گرفت و با استفاده از پروتئین های استاندارد در کیت تهیه شد. تست های immunosorbent  متصل به آنزيم در دو تکرار اجرا شد و برای محاسبه غلظت هر نشانگر، از مقادير متوسط ​​استفاده شد.

_ پروفایل کمپلکس باکتری

 سطوح کمپلکس های نارنجی و قرمز با استفاده از روش ترکیبی DNA DNA- شطرنجی که قبلا توسط Bergamo و همکاران توضیح داده شده است، به صورت در جا تعیین شد. گونه های هدف مورد بررسی از باکتری های کمپلکس نارنجی، Campylobacter rectus (ATCC-33238) Fusobacterium nucleatum (ATCC-25586)، Fusobacterium periodonticum (ATCC-33693)، Prevotella intermedia (ATCC-25611)، Prevotella melaninogenica (ATCC-25845)، Prevotella Nigrescens (ATCC-25261) و باکتری کمپلکس قرمز Porphyromonas gingivalis (ATCC-33277)، Tannerella forsythia (ATCC-43037) و Treponema denticola (ATCC-35405) بودند. تعداد کل گونه ها در هر مجموعه مورد آنالیز قرار گرفتند.

_ تحلیل آماری

آزمون غیر پارامتری فریدمن و ویلکاکسون مورد استفاده قرار گرفت. نرم افزار آماری SPSS 17.0 (بسته نرم افزاری آماری آی بی ام برای Social Sciences، Inc.، Chicago، Illinois، USA). با یک آلفای 05/0 برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده شد.

نتایج

جدول 1 تمام مشخصات آماری جمعیتی و ویژگی های عدم تطابق ردیف های دندانی[1] افراد گنجانده شده را نشان می دهد. ميانگين سنی بيماران 1/0 ± 3/13 سال بود که 55٪ زن بودند. با توجه به نوع malocclusion ، 36.8٪ افراد crowding نوع 1 (در قاعده ی بالا)، 47.4٪ از overbite  نوع 1، و 47.4٪  overjet  نوع 1 بودند (جدول 1 و 2). سطوح سیتوکین (pg / ml) IL-12، IL-6، IL1-α، IL1-β و TNF-α در جدول 3 ارائه شده است. لازم به ذکر است که هیچ تفاوت بین انواع براکت در ابتدا یا 60 روز برای تمام سیتوکین ها مشاهده نشد. p> 0.05)). با این حال، سطح TNF-α از ابتدا تا 60 روز تنها در گروه SmartClip ™ (self-ligating) افزایش یافت. در حالی که در گروههای Gemini™(conventional)  یا  In-Ovation®R(self-ligating)هیچ تغییری متناسب با زمان مشاهده نشد (جدول 4). در آزمایشات باکتری، آزمون فریدمن تفاوت قابل توجهی تنها در مجموعه قرمز p = 0.0074 نشان داد.  تفاوت آماری معنی داری بین براکت های SmartClip ™ و Gemini ™  با استفاده از پس آزمون مشاهده شد (p = 0.016). توزیع کمپلکس باکتریایی در بین براکتها در شکل 1 ارائه شده است. فرضیه ارزیابی رد شد.

بحث

بیماری پریودنتال یک شرایط چند فاکتوری است که شامل عوامل محیطی، میکروبیولوژیکی و میزبان می باشد. به خوبی شناخته شده است که لوازم ارتودنسی، عوامل محیطی درگیر در علت شناسی پیچیده این بیماری هستند. تعاملات پیچیده چند سطحی درگیر در علت شناسی بیماری، هنوز درک نشده است. با توجه به سناریوی پیچیده انجام شده روی واسطه های مختلف التهابی و ضد التهابی با خواص مختلف، این مطالعه با هدف بررسی نقش طراحی براکت در انتشار سیتوکین ها به عنوان عامل میزبان انجام شده است. نتایج ما نشان دهنده نقش طراحی براکت در تغییر سطح سیتوکین بود. GCF یک نمونه مهم برای ارزیابی وضعیت التهابی بافتهای پریودنتال است. در مطالعات درون تن، این یک نشانگر مهم بوم شناسی شیاری و توده پريودنتال است، زيرا شامل سايتوکين ها، محصولات باکتريايی و زير محصولات است. با توجه به اینکه ترکیب و حجم مایع crevicular  دستخوش تغییرات مرتبط با التهاب بافت لثه می شود، تجزیه و تحلیل آنها برای مطالعه تغییرات پاتولوژیک در انسان ها کافی است، زیرا می توان آن را به صورت غیر تهاجمی به دست آورد و اجازه می دهد مکررا از همان محل جمع آوری گردد.  سیتوکینهای موجود در GFC در طول درمان، اطلاعات مربوط به متابولیسم سلولی، سلامت پریودنتال و بازسازی استخوان را فراهم می کنند، زیرا سیتوکین ها همچنین می توانند تمایز و تکثیر osteoclasts  ها را متعادل کنند. IL-6، IL-1α و IL-1-β شناخته شده که موجب تمایز و تکثیر استئوکلاست ها شده و منجر به تحریک بازجذب استخوانی می شود. در طول ارتودنسی، سطح بالایی از IL-6، IL-1α و IL-1-β بر روی سمت متراکم شناسایی می شود. در این مقاله، ارتودنسی سیم در تمام براکت ها بی حرکت نگه داشته شد و این مجموعه پس از تأثیر حرکت ارتودنسی اجرایی شد. ما باید تأکید کنیم که گروهی که In-Ovation®R را دریافت کردند، افزایش در شاخص پریودنتالی ، حجم مایع شکافی، و یا در سطوح باکتریایی کمپلکس نارنجی یا قرمز را نشان نمی دهد. Gemini ™  پایین ترین مقادیر شاخص پریودنتال و سطوح کمپلکس نارنجی / قرمز را نشان داد. SmartClip ™  بالاترین سطوح را برای تمام پارامترهای مورد بررسی ارائه داد. این می تواند نتایج ما را توصیف کند، در حالی که تغییرات در IL-6، IL-1α و IL-1-β مشاهده نشد. IL-12 همراه با مهار جذب استخوان و کاهش حرکت ارتودنسی با مهار osteoclastogenesis  همراه است. IL-12 یک سیتوکین پروالتهابی است که باعث تمایز سلول های T به سلولهای اینترفرون-γ و T-helper 1 می شود (Shaddox et al.، 2011).  پاسخ به اندوتوکسین باکتریایی برای هر گونه پاتوژنی متفاوت است و برخی از لیپوپلی ساکارید های باکتریایی می توانند بیان سیتوکین های پروالتهابی مانند IL-12 را افزایش دهند. IL-12 با TNF-α در دفاع میزبان عمل می کند اما همچنین می تواند TNF-α بیش از حد را مهار کند. در این مطالعه سطح IL-12 به رغم افزایش سطحوح کمپلکس قرمز و TNF-α تغییر نکرد. التهاب خفیف مشخص شده در این نمونه سطح IL-12 را تحت تأثیر قرار نداد. پاسخ میزبان، با واکنش بافتهای پریودنتال به محصولات باکتریایی توسط ترشح سیتوکین ها و ارتقای بازسازی بافت استخوانی بیان می شود. در مطالعه حاضر، ما ذکر کردیم که میزان TNF-α در T1 برای گروه Bracket SmartClip به طور قابل توجهی افزایش یافته است. TNF-α یک سیتوکین است که توسط لنفوسیت ها، فیبروبلاست ها، لکوسیت ها و سلول های اپیتلیال بافت لثه ای ترشح می شود و نقش مهمی در روند التهاب با تحریک جذب استخوان توسط بیان بیش از حد فاکتور هسته ای κB (RANKL) دارد. ترشح آن برای تحریک اندوتوکسین باکتریایی، جزئی از دیواره سلولی میکروارگانیسم های گرم منفی در کمپلکس قرمز، افزایش می یابد  که می تواند التهاب را با پیوستن به سطح براکت، در جا تحریک کند. جالب است که فقط سطح کمپلکس قرمز بین طرح های براکت ها متفاوت بود. در حقیقت، بین تولید سیتوکین های التهابی و وجود گونه های باکتری کمپلکس قرمز ارتباط وجود دارد. همچنین، سیتوکین ها نقش مهمی در تنظیم سیستم دفاعی و سیستم ایمنی میزبان دارند و تحت تأثیر تغییرات پارامترهای پریودنتال (اطراف دندانی) قرار می گیرند. همانطور که قبلا توسط Bergamo و همکاران توضیح داده شده است، (2016)، حجم GCF و شاخص پلاک ، در 60 روز پس از اتصال به گروه براکت SmartClipTM افزایش یافت، که می تواند منجر به التهاب لثه شود و می تواند سطوح سیتوکین پروالتهابی را افزایش دهد، همانطور که در این مطالعه در سطوح TNF-α مشاهده شد. به این ترتیب، از دیدگاه بالینی، مشاهده شد که سطح سیتوکین های پرو التهابی که در سیال شکافی افزایش یافتند، مشابه براکت های Gemini™. (معمولی) و n-Ovation®R (self-ligating) بودند. با این حال، SmartClip ™ (Self-ligating) افزایشی در سطح TNF-α در مایع شکافی نشان داد که احتمالا نشان دهنده پتانسیل التهابی بیشتر است. منطقی است فرض کنیم که بسیاری از عوامل، به تنهایی یا به صورت ترکیبی، به سلامت محیط دهانی در طی درمان ارتودنسی کمک می کنند. با توجه به تأثیر آشکار  انواع مختلفی از طرح های براکت بر روی انباشت پلاک دندانی و تحریک التهابی پاسخ پریودنتال، مطالعات بیشتری برای ارزیابی مدل نمونه بزرگ با حرکت ارتودنسی مورد نیاز است. کارشناسان سایت کلینیک دندانپزشکی دشتستان دنتال بیان می کنند که طراحی براکت بر روی سطوح مجتمع های سیتوکین و باکتری ها تأثیر گذاشت، زیرا براکت SmartClip ™  تغییرات قابل توجهی را نشان داد. بالاترین سطح باکتری های بیماریزا از کمپلکس قرمز به این براکت به طور همزمان با افزایش غلظت TNF-α مشاهده شد.